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大鼠骨髓来源的内皮祖细胞体外培养方法

更新时间:2024-03-18 10:52:25       点击次数:140

1. SD大鼠,250g,通过颈椎脱位处死大鼠,浸入75%乙醇浸泡5分钟,转移到通风柜中的解剖盘中。

2. 打开皮肤,暴露、收集股骨,无菌状态下移除附着的肌肉和组织。

3. 并转移股骨至预冷含双抗的PBS中,洗涤三次。冰上操作。

4. 切断股骨骨骺, 使用5mlPBS1ml注射器针头冲洗,冲洗液由棕色变成粉红色即可(股骨变白)。冲洗后,用1ml注射器吹打3-5次。

5. 70um滤网过滤,弃去筛网。使用 15ml 离心管,先加入分离液,然后缓慢加入滤过的悬液。20℃环境下,600g 离心 25min

6. 离心后,离心管中液体由上至下分为四层。第一层为稀释液层。第二层为环状乳白色单个核细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层。

7. 小心吸取离心管中的,环状乳白色单个核细胞层,转移到新离心管中,加入 5-10ml 洗涤液,混匀细胞。400g,离心 10min

8. 弃去上清,用吸管吸取 5ml 清洗液重悬所得细胞。 250g,离心 10min,弃去上清。 再用M199完全培养基(10 ng/mL VEGF1 ng/mL b-FGF1 ng/mL EGF20%胎牛血清、1%双抗清洗一次,弃去上清,M199完全培养基重悬细胞。250g,离心 10min,弃去上清。M199完全培养基重悬细胞,计数。

9. 3×106/孔种入纤连蛋白包被过的24孔板,每3天换一次培养基,以去除非贴壁细胞,持续诱导培养2-3周。

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