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小鼠脾脏CD8+T细胞的磁珠分选

更新时间:2024-06-25 09:57:42       点击次数:173

一、制备脾脏单细胞悬液

8周龄C57BL/6小鼠摘眼球放血,无菌分离脾脏,于70um滤网上研磨收集脾细胞,过滤、离心,再以RPMI-1640完全培养液重悬。

二、磁珠标记

1. 细胞计数为8×107/mL。

2. 400×g离心4分钟,去除上清。

3.每107个细胞总量使用40μL缓冲液重悬。

4.每107个细胞总量添加10μL CD8+T细胞生物素抗体混合物。

5.混匀,4℃孵育 5分钟。

6.每107个细胞加入2mL缓冲液洗涤细胞,400×g离心4分钟,去上清。

7.每107个细胞添加80μL 缓冲液。

8.每107个细胞添加20μL抗生物素磁珠。

9.混匀,4℃孵育 10分钟。

三、磁珠细胞分选  

1. 将LS分选柱置于相对应的分选器中。

2. 用适当体积的缓冲液润洗分选柱.

3. 将细胞悬液转移至分选柱中,收集含有未标记细胞的流出液,即 CD8+T细胞。

4. 加适量的缓冲液,收集总流出物,并与步骤3中的流出液混合,这CD8+T细胞。

四、流式鉴定

1. 将磁珠分选后得到的CD8+T细胞悬液离心,400 ×g4min,弃去上清

2. 细胞沉淀中加入1 mL完全培养基,计数

3. 从中取出两份细胞(一份大概1×106个细胞),设置为blankCD8+T染色组

4. CD8+T染色组加入200 μL流式染色缓冲液,再加入5 μL Anti-Mo CD8a,吹打均匀,常温避光孵育15min

5. 孵育结束后,PBS洗涤细胞,离心去上清;

6. 加入200 μL流式染色缓冲液,上机检测。

 

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