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蛋白实验检测常见问题及解答,一起来了解一下!

发布时间:2021-09-02 15:58:29       点击次数:225

     蛋白实验检测常见问题及解答
       问题1:为什么选择内参?
  内参也叫看家基因,在组织或细胞中都会表达,且表达量在不同组织或细胞中几乎是相同的,一般有α-Tublin,β-actin,GAPDH等,在WesternBlotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参。其作用有二:
  1.是看提取蛋白质量的好坏。如果做western的时候,内参照蛋白有条带,而目的蛋白没有,说明蛋白的提取和转膜等步骤没有问题,是目的蛋白的抗体质量不好或者是稀释倍数不对。
  2.是比较客观的说明目的蛋白的表达情况,消除上样量等的误差。不同的样品之间由于蛋白提取的量有差别,可能强阳性的表达跑出来的带很弱。因此设立内参照,比较不同样品之间的表达情况。
  问题2:为什么检测的背景比较高?
  1.可能抗体浓度浓度较高。
  2.抗原量较大。
  3.一张膜中有的目的条带较弱,为了能让较弱条带显示出来,曝光时间较长。
  问题3:为什么检测无信号?(白板)
  大概总结为以下几类原因:
  1.样品中目的蛋白丰度很低,低于实验的检测下限。
  3.蛋白降解。
  4.待测样品的确为阴性。
  5.一抗失效。
  6.抗原量不足,每泳道蛋白上样量不低于0.1ug。
  问题4:为什么检测的结果分子量大小与实际不符?
  1.翻译后修饰-比如蛋白的磷酸化,糖基化等,这些都会增加蛋白的分子量大小。
  2.翻译后剪切-比如很多蛋白首先被合成为前体形式,然后通过剪切获得生物学活性。
  3.剪切变异体-相同的基因,经过选择性剪接会产生不同分子量大小的蛋白。
  4.相对电荷-氨基酸的组成(带电vs不带电)。
  5.多聚体-比如蛋白二聚体。

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