中科院1区高分15+！PBA单外泌体蛋白组学助力脓毒症急性肾损伤生物标志物新突破

一、研究背景

1、临床问题：

1）脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）占脓毒症患者的30-50%，死亡率高达50%。

2）当前诊断依赖肌酐和尿量，敏感性低且滞后，缺乏早期标志物。

3）已报道的可溶性早期标志物（NGAL、KIM-1、TIMP2、IGFBP7 等）在“亚临床 AKI”阶段灵敏度不足，且主要反映肾小管/内皮损伤，对肾小球足细胞损伤关注不足。

2、科学基础：

1）尿液细胞外囊泡（uEVs）携带肾脏细胞特异性分子（如足细胞、肾小管标志物），是理想的非侵入性生物标志物来源。

2）但uEVs高度异质性，传统混合检测易遗漏关键亚群信号。

二、研究方法

1、技术突破：单囊泡蛋白质组学

1）建立邻近依赖性条形码检测（Proximity-dependent Barcoding Assay, PBA）：

2）原理：用霍乱毒素B亚基（CTB）捕获uEVs → DNA标记抗体探针结合表面蛋白 → 滚环扩增（RCA）→ 高通量测序解码单囊泡蛋白谱。

3）优势：分辨率达单个囊泡水平，可解析uEVs亚群异质性。

2、研究队列与实验流程

1）筛查队列：8例SA-AKI vs. 8例脓毒症非AKI（PBA鉴定差异uEV亚群）。

2）验证队列：134例SA-AKI患者（诊断/预后评估）。

3）前瞻性队列：72例脓毒症患者（入院12h采样，评估亚临床AKI预测）。

3、多组学溯源

1）单细胞转录组（GSE210622）、空间转录组（KPMP数据库）追溯CD35细胞来源。

2）dSTORM 超分辨成像+Western blot+nano-flow cytometry验证蛋白表达及验证CD35与足细胞标志物Nephrin共定位。

4、统计与机器学习

1）limma 差异蛋白→ 4 种算法（RF、XGBoost、LASSO、SVM-RFE）联合筛选标志物。

2）ROC、KM 生存、Logistic 回归 + 受限立方样条评估独立预测价值。

三、研究结果

1、发现CD35-uEV作为SA-AKI核心标志物

1）筛查阶段：

①PBA鉴定32个uEV亚群，其中补体受体簇（CMR-EV，标志物CD35/CD21）在SA-AKI中比例显著降低。

②单囊泡水平CD35表达下降最显著（AUC=0.92）。

2）验证阶段：

①诊断价值：

区分SA-AKI vs. 非AKI（AUC=0.89）；

预测亚临床AKI（AUC=0.84）。

3）预后价值：

①预测持续性AKI（AUC=0.77）、死亡风险（AUC=0.70）、进展至急性肾病（AKD）（AUC=0.66）。

②低CD35-uEV水平者肾脏恢复时间延长。

2、机制溯源：CD35源自损伤足细胞

1）单细胞转录组：CD35主要表达于足细胞，SA-AKI中表达下调。

2）空间转录组：损伤足细胞中CD35广泛下调。

3）实验验证：94.4%的CD35⁺ uEVs共表达足细胞标志物Nephrin。

3、临床转化潜力

1）联合诊断：CD35-uEV+肾小管标志物TIMP2*IGFBP7→诊断AUC提升至0.87。

2）特异性：CD35-uEV在缺血性AKI（心脏术后）无变化，提示其对SA-AKI的特异性。

四、研究结论

1）标志物价值：CD35-uEV是首个基于足细胞损伤的SA-AKI非侵入性标志物，可用于：早期诊断（亚临床阶段）、风险分层（严重度/持久性/死亡风险）。

2）病理机制：SA-AKI存在显著足细胞损伤（CD35下调），补体调节紊乱可能是关键机制。

3）临床策略：肾小球（CD35-uEV）与肾小管（TIMP2*IGFBP7）标志物联用提升诊断精度。

五、早期靶点筛查策略：

1. 技术创新驱动靶点发现

1）单囊泡分析：解决组织异质性（如uEVs亚群），锁定传统方法遗漏的稀有信号（如仅占1.6%的CD35⁺囊泡）。

2）多组学整合：

①空间转录组定位靶点起源（足细胞）；

②单细胞测序解析细胞状态变化（损伤足细胞去分化）。

2、靶点筛选与验证流程：

1）筛选及验证流程图：

2）关键步骤：

①初筛：差异表达分析（如limma包）→ 44个候选蛋白。

②精选：4种机器学习算法（随机森林/XGBoost等）交叉验证 → 锁定CD35。

③验证：多中心队列+前瞻性队列+外部数据库（KPMP）。

3、临床转化设计要点

1）时间窗：在亚临床期采样（如脓毒症入院12h内），证明早于肌酐升高。

2）预后分层：关联短期（AKI持续化）、长期（死亡/AKD）结局，增强临床实用性。

3）组合策略：新型标志物（CD35-uEV）与已批准标志物（TIMP2*IGFBP7）联用，加速临床落地。

4、差异化优势构建

1）器官特异性：追溯靶点细胞起源（如足细胞），避免血液来源干扰。

2）疾病特异性：验证靶点在其他病因AKI中的表达（如心脏术后AKI无变化），提升特异性。

总结：单囊泡分辨、多组学溯源、跨队列验证、联合模型是早期筛查靶点发现的“黄金四要素”。