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带您了解一下原位杂交检测步骤

发布时间:2021-10-08 13:47:11       点击次数:87

  带您了解一下原位杂交检测步骤
  原位杂交涉及的步骤:玻片的准备和样品固定,细胞或组织的预渗透处理,靶DNA变性(DNA原位杂交),探针制备,原位杂交过程,杂交后洗涤,探针(显色)检测。
  1.玻片的准备和样品固定
  对于染色体涂片,1:1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交,为了在实验过程中不丢失组织样品,可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。
  样品的固定步骤是为了保持样品的原有形态学。样品固定是原位杂交中必不可少的步骤,从化学反应角度来看,固定剂的使用和选择对后续杂交的影响不会太大,因为核酸杂交的功能分子基团被安全地包裹在DNA双螺旋结构中,而交联剂的使用对RNA基本没有影响。对于染色体涂片,常使用甲醇/醋酸溶液固定;石蜡包埋的组织切片用福尔马林固定。冷冻切片可通过在4%的甲醛溶液中固定30min,或使用Bouin固定剂。
  2.样品预处理
  在待测样品中,DNA或RNA通常都是被蛋白包裹缠绕,根据不同的细胞和组织样品的应用,可选择合适的预处理方法将靶核酸暴露:
  内源性酶灭活:如果探针的检测是通过酶促法进行的,则样品内相应的内源性酶必须被灭活。如内源性的POD可通过含1%H2O2的甲醛溶液处理30min。如果检测酶为AP,可在底物溶液中加入左旋咪唑,AP检测的内源性背景一般来说比POD检测的低得多,因为在杂交过程中,样品中内源性AP酶的活性基本都丧失了。
  RNase处理:在DNA-DNA杂交实验中,RNase的处理可去除内源性RNA,增加实验的信噪比。在进行mRNA为靶标的检测时,RNase处理的样品也可作为质控对照。通常的处理方式是将DNase-free的RNase溶解于2×SSC(100μg/ml),样品在溶液中37℃处理60min。
  SSC=150mMNaCl,15mM柠檬酸钠溶液(pH7.4)
  HCl处理:对样本进行20-30min的200mMHCl处理,可将蛋白抽提,并将核酸序列进行一定程度的水解,增加杂交检测的信噪比。
  去垢剂处理:如果对样品的固定、脱水、包埋等预处理过程不足以将脂膜成分破坏暴露核酸,可对样品进行额外的蛋白去垢剂处理(如TritonX-100和SDS)。
  蛋白酶处理:样品中待杂交的核酸序列常与蛋白缠绕交联在一起,样品的固定步骤更是加剧了蛋白的交联程度,因此预渗透是核酸杂交前的常规步骤,通常通过蛋白酶K的消化作用来完成。根据不同的文献来源,蛋白酶K的工作浓度通常设为10-500μg/ml(溶解于20mMTris-HCl,2mMCaCl2,pH7.4,酶浓度可根据具体样品进一步优化),对样品进行37°C7.5–30min的处理。染色体涂片或核片的蛋白酶K处理浓度可降至1μg/ml消化7.5min。也有文献指出,福尔马林固定石蜡包埋的组织切片样品,使用胃蛋白酶(500μg/ml,溶于200mMHCl)将得到较好的蛋白消化结果。
  对于结缔组织,肝组织等样品,还可进行Collagenase和Dispase的组织消化处理,以降低背景。
  3.探针制备
  在进行研究前,确定应用的探针类型。不同探针类型的优劣势请见上文描述。DNA探针的制备包括了前期的DNA片段分离纯化(或cDNA的克隆)和酶促探针标记,可选随机引物标记法和缺口平移法等。RNA探针的制备包括了转录载体克隆和转录法探针标记。寡核苷酸探针的制备要求先获得合成的寡核苷酸片段,再进行末端标记或加尾法探针标记。但无论采用何种标记探针及标记方法,对探针标记效果需进行最终的评估,并准确计算探针浓度。
  4.原位杂交过程
  杂交前可进行预杂交,以防止较高的背景染色。预杂交条件与杂交条件相同,只是预杂交液中不含探针和硫酸葡聚糖。
  靶DNA的变性(对mRNA的原位杂交无需此步)
  样品DNA的变性在DNA-DNA杂交检测中是必须的步骤,但同时可能会造成样品形态学的部分破坏,此步是实验中需要优化的一个步骤。常用的变性方法为碱变性和热变性,实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得最佳条件。
  如使用热变性方法,可在杂交时将探针的变性和样品DNA变性同步进行:将样品和探针溶液加盖盖玻片,置于烘箱80℃变性,染色体DNA样品处理2min,后冷却至37℃进行杂交。组织样品DNA的变性时间可增加至80℃10min。
  以上就是原位杂交检测步骤

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