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PCR反应混合物的分子实验检测步骤介绍

发布时间:2021-11-02 15:26:52       点击次数:233

  进行分子实验检测时需要先准备PCR反应混合物:根据DNA样本的数量来确定除了DNA外其他混合物的体积(额外增加一份来确保有足够的PCR反应混合物),将扩增每一个遗传标记并且在每一个PCR反应管内分19.5uL的反应混合物。
  配制胶溶液:将25g尿素、7.5mL40%丙烯酰胺:PDA(19:1)加入到250mL的锥形瓶中。加蒸馏水至50mL,充分混匀来溶解尿素(见注释4)。
  准备制胶板:把胶板洗干净,确保上面没有灰尘,用硅化玻璃板。根据各个厂家的不同把玻璃板夹在一起并且用胶条封住底部(这一过程根据设备的不同而有所变化)。
  如果不用带有加热盖的PCR仪,那么就需要在每个管子的顶部加入矿物油来防止液体蒸发。
  进行分子实验检测时在每个管子中加0.5的DNA样本。
  把管子放在PCR仪中,95℃加热3min变性DNA。
  95℃变性40s、55℃引物退火40s、72℃延伸40s,循环30-35次。
  把PCR产物和尿素上样缓冲液1:1混合.
  加入500uL10%的过硫酸铵到胶混合液中并且通过滤纸过滤。
  取出10mL胶溶液加入到一个小烧杯中并且加10~15。马上将胶倒到板上。几分钟之内胶将聚合到一起,封玻璃板的底部。
  封好胶后,加15ul到剩余的胶溶液中并且马上把胶倒到两块胶板之间。仔细插入胶梳子,让胶聚合2h至过夜。
  取下胶底部的封条。把胶放在电泳槽中确保电极插入的方向正确。将胶槽中灌满(大约1.5L,根据装置的不同量有所不同)。拔掉胶梳子,冲洗上样孔。
  把胶预热60min直到温度在50℃左右。
  在上样之前再次用加样器冲洗上样孔。在每个孔中加产物和上样染料(上样量根据梳子的大小和PCR产物的浓度而不同)。根据产物片段大小的不同跑胶时间可以从30min到3h之间变化。

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