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浅析COIP的正确操作步骤!小编来带你了解一下!

发布时间:2021-11-04 10:12:49       点击次数:200

  浅析COIP的正确操作步骤!小编来带你了解一下!
  一、细胞的甲醛交联与超声破碎(第一天)
  1.取出1平皿细胞(10cm平皿),加入243ul37%甲醛,使得甲醛的终浓度为1%(培养基共有9ml)。
  2.37℃孵育10min。
  3.终止交联:加甘氨酸至终浓度为0.125M。450ul2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后,在室温下放置5min即可。
  4.吸尽培养基,用冰冷的PBS清洗细胞2次。
  5.细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中(PBS依次为5ml,3ml和3ml)。预冷后2000rpm5min收集细胞。
  6.倒去上清。按照细胞量,加入SDSLysisBuffer。使得细胞终浓度为每200ul含2x106个细胞。这样每100ul溶液含1x106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5x106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4x106个细胞。因此每管加入400ulSDSLysisBuffer。将2管混在一起,共800ul。
  7.超声破碎:VCX750,25%功率,4.5s冲击,9s间隙。共14次。
  二、除杂及抗体哺育(第一天)
  1.超声破碎结束后,10000g4℃离心10min。去除不溶物质。
  2.留取300ul做实验,其余保存于-80℃。
  3.300ul中,100ul加抗体做为实验组;100ul不加抗体做为对照组;100ul加入4ul5MNaCl(NaCl终浓度为0.2M),65℃处理3h解交联,跑电泳,检测超声破碎的效果。
  4.在100ul的超声破碎产物中,加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50xPIC。
  再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转混匀1h。
  5.1h后,在4℃静置10min沉淀,700rpm离心1min。
  6.取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体,另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。
  三、检验超声破碎的效果(第一天)
  1.取100ul超声破碎后产物,加入4ul5MNaCl,65℃处理2h解交联。
  2.分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。
  四、COIP免疫复合物的沉淀及清洗(第二天)
  1.孵育过夜后,每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4℃颠转2h。
  2.4℃静置10min后,700rpm离心1min。除去上清。
  3.依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤:加入溶液,在4℃颠转10min,4℃静置10min沉淀,700rpm离心1min,除去上清。
  洗涤溶液:
  (1)lowsaltwashbuffer-onewash
  (2)highsaltwashbuffer-onewash
  (3)LiClwashbuffer-onewash
  (4)TEbuffer-twowash
  4.清洗完毕后,开始洗脱。
  洗脱液的配方:100ul10%SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共1ml。
  每管加入250ul洗脱buffer,室温下颠转15min,静置离心后,收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。
  5.解交联:每管中加入20ul5MNaCl(NaCl终浓度为0.2M)。
  6.混匀,65℃解交联过夜。
  五、DNA样品的回收(第三天)
  1.解交联结束后,每管加入1ulRNaseA(MBI),37℃孵育1h。
  2.每管加入10ul0.5MEDTA,20ul1MTris.HCl(PH6.5),2ul10mg/ml蛋白酶K。45℃处理2h。
  3.DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ulddH2O。
  

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