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ZFNs 是第一代可编程基因编辑工具，通过融合 DNA 结合域（锌指蛋白）与 DNA 切割域（FokI 核酸酶）实现靶向编辑：
锌指蛋白结构域：
由 30-34 个氨基酸重复单元构成，每个单元通过 第 12、13 位可变残基（RVDs） 识别特定碱基：
| RVD 类型 | 识别碱基 | 特异性 |
|---|---|---|
| NI | A | 高 |
| NG | T | 高 |
| HD | C | 高 |
| NN | G/A | 中等 |
单个锌指识别 3 bp，串联 3-6 个可靶向 9-18 bp 序列。
FokI 切割域：
需 二聚化 才能激活切割功能 → ZFNs 需成对设计（左臂/右臂），切割位点位于两臂结合位点之间（间隔区 5-7 bp）。
编辑机制：
双链断裂（DSB）→ 细胞启动修复路径：
非同源末端连接（NHEJ） ：随机插入/缺失（Indels），导致基因敲除。
同源定向修复（HDR） ：需外源修复模板（如 ssODN），实现点突变或基因插入。
技术突破：shou次实现哺乳动物基因组靶向编辑（2005 年），开启精准基因编辑时代 。
| 步骤 | 核心操作 | 创新优化 |
|---|---|---|
| 靶点设计 | 避开高重复/甲基化区域，间隔区 5-7 bp | 软件预测（ZiFiT）提升结合效率 |
| 锌指组装 | 模块化串联法： |
3-6 个锌指单元串联
Golden Gate 克隆（BsaI/BsmBI） | 6 天完成构建，成功率 >80% |
| 表达载体 | 双启动子载体（CMV/T7），支持 mRNA 合成与蛋白表达 | 适配多物种（斑马鱼、小鼠、猪） |
| 递送方式 | - 受精卵显微注射 ZFNs mRNA
体细胞转染 + 核移植（大型动物） | mRNA 递送减少脱靶 |
| 修复增强 | 联合 ssODN 模板 + NHEJ 抑制剂（SCR7） | HDR 效率提升 3 倍 |
| 物种 | 靶基因 | 疾病模型 | 效率/表型 | 研究价值 |
|---|---|---|---|---|
| 斑马鱼 | golden | 白化病 | 95% F0 代色素缺失 | 发育基因功能筛选 |
| 小鼠 | Rag2/IL2rg | 免疫缺陷模型 | 双基因敲除，人源化移植平台 | 肿瘤免yi治疗研究 |
| 猪 | GGTA1 | 异种器guan移植模型 | 敲除 α-Gal 抗原，降低超急性排斥 | 人源化器官开发 |
| 果蝇 | yellow | 体色突变 | 生殖系突变率 5.7%（动物模型） | 基因功能保守性验证 |
高 GC 区域编辑：
无 PAM 序列限制，可靶向 CRISPR/Cas9 无法编辑的区域 。
低脱靶率需求：
治疗性编辑中脱靶率 <0.1%（CRISPR 为 1-10%）。
大型动物模型：
猪、牛等物种中免疫原性低于 CRISPR 。
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