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一、cKO小鼠模型构建技术路线选择
方法 | 周期 | 适用场景 | 关键优势 |
CRISPR-Cas9 + HDR | 3-6个月 | 快速构建floxed小鼠 | 无需ES细胞，直接受精卵操作 |
ES细胞同源重组 | 8-12个月 | 复杂设计（如大片段floxed） | 精准度高，适合商业化品系开发 |
Cre-loxP系统 | 需两代交配 | 组织特异性/诱导型敲除 | 时空可控性最强 |
二、cKO小鼠模型构建核心步骤详解
1. 靶向策略设计
loxP位点插入：
选择关键外显子（通常第2-4号外显子），两侧插入loxP序列（34 bp）。
设计原则：删除后导致移码突变或功能域缺失（需蛋白结构预测）。
避免干扰：确保loxP不破坏相邻基因的启动子或增强子。
2. 打靶载体构建（以ES细胞法为例）
5'同源臂 1.5-3kb
loxP
目标外显子
loxP
3'同源臂 1.5-3kb
NeoR筛选标记
DTA负选标记
3. 基因修饰小鼠制备
CRISPR法：
注射混合物：Cas9 mRNA + 2条sgRNA（靶向loxP插入位点） + ssDNA供体（含loxP序列）。
优化要点：使用化学修饰的ssDNA供体提高HDR效率（如IDT的Ultramer）。
ES细胞法：
通过电转将线性化载体转入ES细胞，G418筛选后PCR验证正确重组克隆。
4. floxed小鼠鉴定
基因型检测：
引物设计：
F1: 5'-同源臂外侧
R1: loxP序列内侧
预期条带：野生型（无loxP）和floxed（有loxP）差异≥100 bp。
测序验证：确保loxP方向正确（正向重复）。
5. 与Cre小鼠交配
Cre品系选择：
Cre类型 | 代表品系 | 应用 |
组织特异性 | Alb-Cre（肝脏） | 代谢研究 |
Nestin-Cre（神经系统） | 神经发育 | |
诱导型 | CAG-CreERT2（全身诱导） | 他莫昔芬给药后敲除 |
发育阶段特异性 | Sox2-Cre（早期胚胎） | 胚胎致死基因研究 |
交配策略：
自交
floxed/floxed
Cre阳性
F1: floxed/+ Cre+
F2: floxed/floxed Cre+
6. 敲除效率验证
qPCR/WB：比较Cre阳性和阴性组织的基因表达。
报告基因：若设计时引入tdTomato等，可直接荧光观察。
三、常见问题解决方案
问题 | 原因 | 优化策略 |
loxP重组失败 | 同源臂太短或HDR效率低 | 延长同源臂至2 kb，使用HDR增强剂（如Rad51） |
背景敲除 | Cre渗漏表达 | 选择低渗漏Cre品系（如CreERT2） |
表型不一致 | 遗传背景混杂 | 回交至纯合背景（>N6） |
四、x技术升级
双loxP系统（如lox2272）：实现可逆敲除，避免传统loxP的不可逆性。
CRISPR-Cas9 + 转座子：通过PB转座子携带loxP，提高插入效率（适合难靶向位点）。
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