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| 方法 | 周期 | 成本 | 适用场景 | 优势/劣势 |
|---|---|---|---|---|
| CRISPR-Cas9 | 2-4个月 | 低至中 | 简单敲除、短片段插入 | 快、成本低，但可能脱靶 |
| ES细胞同源重组 | 6-12个月 | 高 | 复杂修饰（如条件性KO、大片段替换） | 精准，但周期长、需显微操作 |
| Base Editing | 3-5个月 | 中至高 | 单碱基敲除（无DSB） | 避免双链断裂，但效率较低 |
靶点选择：
针对目标基因的外显子（优先选择首ge编码外显子）。
使用在线工具（如Benchling或CRISPR Design）避免脱靶。
合成gRNA：化学合成或体外转录（需加5'端G增强转录效率）。
供体DNA：若需同时插入报告基因（如GFP），需设计同源臂（~800 bp）。
注射混合物：
Cas9 mRNA（50 ng/μL） + gRNA（25 ng/μL） ± 供体DNA（100 ng/μL）。
胚胎操作：
注射C57BL/6或BALB/c品系受精卵（原核期）。
移植至假孕母鼠子宫（约30个胚胎/母鼠）。
F0代筛查：
PCR + 测序：检测Indel突变（引物设计在gRNA靶点外）。
T7E1或Surveyor assay：快速检测切割效率。
传代验证：F0可能为嵌合体，需与野生型交配获得F1杂合子。
完quanKO验证：qPCR/Western blot确认基因表达缺失。
表型检测：根据基因功能设计（如代谢、行为学、病理分析）。
同源臂：5'和3'臂各1.5-3 kb， flanking 目标外显子。
筛选标记：NeoR（正选择）和TK（负选择，如HSV-TK）。
电转递送：将线性化载体转入JM8或E14 ES细胞。
药物筛选：G418（NeoR） + 更xi洛韦（TK阴性筛选）。
显微注射：将阳性ES细胞注入C57BL/6囊胚。
嵌合体鉴定：毛色嵌合（如129 ES细胞→B6母鼠）。
嵌合体（公鼠）与野生型交配，筛选后代基因型。
设计floxed小鼠：
在目标外显子两侧插入loxP位点（需同源重组或CRISPR-HDR）。
与Cre小鼠交配：
选择组织特异性Cre品系（如Alb-Cre用于肝脏敲除）。
验证敲除效率：
在目标组织中检测基因缺失（避免全身性表型干扰）。
| 问题 | 原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| F0无突变 | gRNA效率低或Cas9活性不足 | 优化gRNA设计，提高注射浓度 |
| 嵌合体不传代 | ES细胞贡献不足 | 改用高贡献率ES细胞系（如JM8A3.N1） |
| 非预期表型 | 脱靶效应或相邻基因影响 | 多独立品系验证，全基因组测序排查 |
| 条件性KO不完quan | Cre表达效率低 | 换用强效Cre品系（如UBC-CreERT2） |
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