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微生物：细菌（如大肠杆菌、乳酸菌）、酵母（如毕赤酵母）、丝状真菌、噬菌体等。
细胞系：哺乳动物细胞（如HEK293、HeLa）、干细胞、原代细胞等。
特殊样本：难培养微生物（如厌氧菌）、基因编辑菌株（如CRISPR改造菌）。
| 项目 | 描述 |
|---|---|
| 标准冻存 | 使用甘油或DMSO冻存液，-80℃或液氮保存。 |
| 优化冻存方案 | 针对脆弱菌种（如支原体）定制冻存保护剂。 |
| 复苏验证 | 冻存后复苏，检测存活率、污染及功能（如质粒保留、基因表达）。 |
| 库存管理 | 提供条形码标签、电子数据库记录（冻存时间、位置、基因型等）。 |
| 快递运输 | 干冰或液氮罐运输冻存管，确保全程低温。 |
前处理：
培养至对数生长期（OD600≈0.6-0.8）。
离心收集菌体，去除残留培养基（避免冷冻损伤）。
冻存液制备：
常用保护剂：15-30%甘油（细菌）或10% DMSO（哺乳细胞）+培养基。
特殊配方：如海藻糖（提高真菌存活率）。
分装与标记：
分装至冻存管（推荐1.5 mL螺口冻存管），标注菌株名称、日期、浓度。
冷冻程序：
梯度降温：4℃ 30 min → -20℃ 1 h → -80℃长期保存（或直接液氮气相）。
程序冷冻仪：精确控制降温速率（如1℃/min，适用于敏感细胞）。
液氮保存：
转移至液氮罐（气相：-150℃至-196℃），避免液相中管爆裂。
快速解冻（37℃水浴，<1 min）。
涂板或液体培养，检测：
存活率（CFU计数 vs 冻前）。
遗传稳定性（PCR验证目标基因、质粒保留率）。
污染检测（无抗生素平板培养、16S rRNA测序）。
保护剂优化：
细菌：甘油浓度需匹配菌种（如乳酸菌需20%甘油+5%脱脂奶粉）。
细胞：血清替代物（如HyClone FBS）减少批次差异。
冷冻速率：
快速冷冻（直接-80℃）适合多数细菌，慢速冷冻（程序降温）适合真核细胞。
| 问题 | 原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 复苏后无生长 | 保护剂浓度不当或冻存液未混匀 | 重新优化保护剂，涡旋混匀后再冻存。 |
| 细胞破裂 | 冰晶形成（降温过慢） | 添加冷冻保护剂（如DMSO），程序降温。 |
| 污染（真菌/支原体） | 冻存前样本不纯或操作污染 | 冻存前抗生素处理、PCR检测。 |
-80℃：细菌通常2-5年，酵母1-3年（定期复苏验证）。
液氮：>10年（需避免温度波动）。
干冰运输：维持-78℃，适合短期（<3天）。
液氮罐：长期运输需专业容器（如Taylor-Wharton液氮罐）。
风险较低，但建议：
保存早期传代菌株（避免累积突变）。
关键菌株备份多管（避免反复冻融）。
菌种鉴定：16S rRNA测序、MALDI-TOF质谱分析。
专l保藏：协助提交至中国典型培养物保藏中心（CCTCC）或ATCC。
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