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细胞基因编辑

简要描述:细胞基因编辑服务:基因编辑技术在细胞层面的应用(如肿瘤细胞系、原代细胞、iPSCs等)是研究基因功能、疾病机制和药物筛选的核心手段

  • 更新时间:2025-06-26 17:27:41
  • 访  问  量:4

详细介绍

一、细胞基因编辑服务选择与适用场景

技术编辑类型效率适用场景
CRISPR-Cas9敲除/短片段插入基因KO、报告基因敲入
碱基编辑(ABE/BE)单碱基转换SNP纠正(如C→T或A→G)
Prime Editing精准插入/缺失低-中复杂突变(无需DSB)
CRISPRa/i基因激活/抑制-表观调控研究

二、细胞基因编辑服务CRISPR-Cas9基因敲除(KO)流程

1. gRNA设计
  • 工具推荐

  • 设计原则

    • 靶向s个编码外显子(确保移码突变)。

    • 避免脱靶(使用CRISPRoff预测)。

2. 载体选择
  • 质粒系统

    • lentiCRISPRv2(带Puromycin抗性)。

  • RNP系统

    • Cas9蛋白 + sgRNA(高编辑效率,低脱靶)。

3. 细胞转染/转导
细胞类型递送方法条件
HEK293T脂质体(Lipo3000)70%密度,24h后换液
原代T细胞电转(Neon系统)1600V, 10ms, 3 pulses
iPSCs慢病毒(低MOI)加Polybrene(8 μg/mL)
4. 筛选与验证
  • 抗生素筛选

    • Puromycin(1-5 μg/mL,48-72h)。

  • 基因型鉴定

    • T7E1/Surveyor assay:快速检测Indel。

    • Sanger测序:TA克隆后分析突变类型。

  • 功能验证

    • Western blot(蛋白水平敲除)。


三、基因敲入(KI)与点突变(PM)

1. HDR介导的敲入
  • 供体设计

    • ssODN(100-200 nt):同源臂40-60 nt + 插入序列。

    • 质粒供体:需1 kb同源臂(适合大片段插入)。

  • 增强HDR

    • 添加RS-1(终浓度7.5 μM)或NU7026(DNA-PK抑制剂)。

2. 碱基编辑(C→T或A→G)
  • 系统选择

    • BE4max(C→T):窗口位点4-8。

    • ABE8e(A→G):窗口位点4-7。

  • 转染条件

    • 质粒或RNP(72h后检测效率)。

3. Prime Editing
  • PE2/PE3系统

    • pegRNA设计需包含RT模板和PBS序列(使用PE-Designer)。


四、原代细胞与难转染细胞优化

挑战解决方案
低转染效率电转优化(如原代B细胞用Amaxa Nucleofector)
高毒性使用RNP(比质粒更温和)
克隆形成率低流式分选(GFP报告系统)或有限稀释法

五、质量控制与脱靶分析

1. 编辑效率检测
  • NGS:扩增靶位点后深度测序(>10,000X)。

  • 流式细胞术:若插入报告基因(如GFP)。

2. 脱靶评估
  • 预测工具

  • 实验验证

    • 全基因组测序(WGS)或GUIDE-seq。


六、经典应用案例

编辑类型应用案例
TP53 KO肿瘤细胞增殖研究验证p53在化疗耐药中的作用
BCL11A增强子编辑胎儿血红蛋白再激活镰刀型贫血治疗研究
ROS1 G2032R KI靶向药物耐药模型克唑替尼耐药机制探索


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