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| 技术 | 编辑类型 | 效率 | 适用场景 |
|---|---|---|---|
| CRISPR-Cas9 | 敲除/短片段插入 | 高 | 基因KO、报告基因敲入 |
| 碱基编辑（ABE/BE） | 单碱基转换 | 中 | SNP纠正（如C→T或A→G） |
| Prime Editing | 精准插入/缺失 | 低-中 | 复杂突变（无需DSB） |
| CRISPRa/i | 基因激活/抑制 | - | 表观调控研究 |
质粒系统：
lentiCRISPRv2（带Puromycin抗性）。
RNP系统：
Cas9蛋白 + sgRNA（高编辑效率，低脱靶）。
| 细胞类型 | 递送方法 | 条件 |
|---|---|---|
| HEK293T | 脂质体（Lipo3000） | 70%密度，24h后换液 |
| 原代T细胞 | 电转（Neon系统） | 1600V, 10ms, 3 pulses |
| iPSCs | 慢病毒（低MOI） | 加Polybrene（8 μg/mL） |
抗生素筛选：
Puromycin（1-5 μg/mL，48-72h）。
基因型鉴定：
T7E1/Surveyor assay：快速检测Indel。
Sanger测序：TA克隆后分析突变类型。
功能验证：
Western blot（蛋白水平敲除）。
供体设计：
ssODN（100-200 nt）：同源臂40-60 nt + 插入序列。
质粒供体：需1 kb同源臂（适合大片段插入）。
增强HDR：
添加RS-1（终浓度7.5 μM）或NU7026（DNA-PK抑制剂）。
系统选择：
BE4max（C→T）：窗口位点4-8。
ABE8e（A→G）：窗口位点4-7。
转染条件：
质粒或RNP（72h后检测效率）。
PE2/PE3系统：
pegRNA设计需包含RT模板和PBS序列（使用PE-Designer）。
| 挑战 | 解决方案 |
|---|---|
| 低转染效率 | 电转优化（如原代B细胞用Amaxa Nucleofector） |
| 高毒性 | 使用RNP（比质粒更温和） |
| 克隆形成率低 | 流式分选（GFP报告系统）或有限稀释法 |
NGS：扩增靶位点后深度测序（>10,000X）。
流式细胞术：若插入报告基因（如GFP）。
预测工具：
实验验证：
全基因组测序（WGS）或GUIDE-seq。
| 编辑类型 | 应用 | 案例 |
|---|---|---|
| TP53 KO | 肿瘤细胞增殖研究 | 验证p53在化疗耐药中的作用 |
| BCL11A增强子编辑 | 胎儿血红蛋白再激活 | 镰刀型贫血治疗研究 |
| ROS1 G2032R KI | 靶向药物耐药模型 | 克唑替尼耐药机制探索 |
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