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分子克隆与载体构建

简要描述:DNA片段的克隆需要合适的载体,载体或是质粒,或是噬菌体,或是病毒,通常大多经过人工改造。作为载体必须具备两条件:一是该载体在细胞内必须能自主复制,即必须具备复制原点;二是该载体必须具备适合的酶切位点,且这些酶切位点不在复制原点区域内。以上两条,保证了载体的可繁殖性和可利用性。为了便于获得阳隆克隆,载体上常有筛选标记,如对抗菌素的抗性,某些基因产物的显色反应等。

  • 更新时间:2021-07-09 15:23:30
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详细介绍

一、分子克隆与质粒载体构建实验Molecular cloning 服务介绍

分子克隆是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因,用体外重组方法将它们插入克隆载体,形成重组克隆载体,通过转化与转导的方式,引入适合的寄主体内得到复制与扩增,然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆载体,可以得到插入DNA的许多拷贝,从而获得目的基因的扩增。

二、分子克隆与质粒载体构建实验Molecular cloning 实验原理

外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2%2B、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种:T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠杆菌连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

    T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步:先,T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物;然后,酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;后产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。

    DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法,为了防止载体本身的自连,可以通过(牛小肠碱性磷酸酶)CIP处理克服。

    连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性.但是在这个温度下,粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。

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