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Western Blot

简要描述:一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志,检测蛋白质的方法很多,除ELISA法外,也可用与检测DNA和RNA相类似的吸印方法。前两法有“南”和“北”之意,故本法遂被延伸称为Western(西)印迹法,该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。

  • 更新时间:2021-07-09 15:29:06
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详细介绍

样品准备

组织样品:

将组织剪成细小的碎片,按每20mg组织加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂),匀浆器匀浆直至完全裂解。裂解后的样品4℃ 12000g 离心15分钟,取上清,进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱。

1.蛋白定量;

2. 根据样品数量,将BCA试剂A与试剂B按体积比为50:1配制适量BCA工作液,充分混匀;

3. 各孔加入160μl BCA工作液;

4. 把酶标板放在振荡器上振荡30sec,37℃放置30分钟,然后在562nm下测定吸光度。以吸光值为横坐标,蛋白浓度(μg/μl)为纵坐标,绘出标准曲线;

5. 在酶标板中加入2μl待测蛋白和18μl PBS(稀释10倍),加入160μl BCA工作液,把酶标板放在振荡器上振荡30sec,37℃放置30分钟,然后在562nm下测定吸光度。

6. 根据所测样品的吸光值,在标准曲线上即可查得相应的蛋白浓度(μg/μl),乘以样品稀释倍数(10)即为样品实际浓度(单位:μg /μl)。

PAGE胶的制备

1. 下层分离胶的制备

    根据目的蛋白的分子量选择不同的凝胶浓度,高分子量蛋白用低浓度胶,低分子量蛋白用高浓度胶分离。   P62 60kDa   LC3B 14,16kDa  GAPDH  37kDa   故选用  10%  和15%  的胶。   不同浓度的分离胶按下表进行配制,待下层胶凝固后进行上次浓缩胶的配制。

2. 上层浓缩胶的配制

根据需要按下表配制浓缩胶,并插好梳子。

上样及电泳

1. 上样

每孔上样量约为       15    μl蛋白,可以根据实验要求加大上样量。根据蛋白定量结果取所需蛋白加入适量上样缓冲液,沸水浴10min后离心取上清上样。将配制好的PAGE胶放入电泳槽中,加入适量电泳缓冲液,取下梳子用枪轻轻吹打加样孔,避免孔内有余胶残留影响上样。将准备好的样品用加样枪慢慢加到对应的孔内,注意勿溢出加样孔。

2. 电泳

一般浓缩胶80V 20分钟,分离胶120V 60分钟,可以根据具体实验要求调整电压和时间。当染料到达胶底部时切断电源,停止电泳,进行下一步转膜。

转膜

转膜分为湿转和半干转,本实验室选用半干转。    

半干式转膜中,三明治的排列为:/虑纸/胶/膜/虑纸,用电转缓冲液浸湿后,直接置于电转仪的正负极之间。胶于负极而膜置于正极。半干式的电转缓冲液不同于湿式的电转缓冲液,推荐为:48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇。25V转膜30分钟即可。转膜前将PVDF膜在甲醇中浸泡1-2 分钟(NC膜在电转液中浸泡10-20分钟),再孵育于冰冷的电转缓冲液中5 分钟,胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡3-5 分钟,否则转膜时会导致条带变形。

膜上蛋白的检测

    为检测转膜是否成功,可用丽春红染色,丽春红染色工作液:2%的丽春红贮备液1:10 稀释,即加9 倍的ddH2O

染色方法:将膜放入TBST 洗一次,再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色5 分钟,大量的水洗膜直至水变清无色蛋白条带清晰,(膜也可以用TBST 或水重新洗后再进行染色)PVDF 膜需用甲醇再活化后用TBST洗后进行封闭。

膜的封闭及抗体孵育

1. 封闭:5%脱脂奶粉(检测磷酸化蛋白用BSA)室温封闭1小时或4℃过夜。

2. 一抗:根据说明书   P62 1:1000  LC3B 1:1000    GAPDH 1:2000  稀释抗体,抗体加入封闭液中稀释到所需浓度,和膜室温孵育2小时或4 ℃孵育过夜。

3. 二抗:孵育一抗的膜用TBST洗涤3次,每次5min。随后根据用量,按照1:1000稀释HRP标记的二抗,与膜37℃孵育1h。用TBST洗涤3次,每次5min。

显色

ECL化学发光检测:配制ECL发光液,根据用量,取ECL发光液A和B等量混匀,加在膜的正面暗室避光5分钟。倒掉显色液,用纸小心吸取显色液,在上面盖上一层平整的透明纸。将其放入成像系统中进行扫描。可以根据条带强弱再次感光或减短感光时间已达到理想结果。

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