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一、PM小鼠模型构建技术路线选择
方法 | 周期 | 精度 | 适用场景 |
CRISPR-Base Editing | 2-3个月 | 单碱基 | C→T或A→G转换（无需DSB） |
CRISPR-HDR | 3-5个月 | 任意突变 | 需设计ssODN供体 |
ES细胞同源重组 | 6-12个月 | 最高 | 复杂突变（如大片段替换+点突变） |
二、PM小鼠模型构建CRISPR-HDR方案（当前常用）
1. 靶点设计与工具选择
gRNA设计：
靶向突变位点附近（距离<10 bp），使用Benchling优化特异性。
推荐工具：
单碱基编辑：ABE8e（A→G）或BE4max（C→T）编辑器。
HDR修复：高保真Cas9（如HiFi Cas9） + 化学修饰ssODN供体。
2. ssODN供体设计
5'同源臂 40-60nt
目标突变+沉默突变*
3'同源臂 40-60nt
沉默突变：在PAM序列或gRNA靶区引入1-2 bp沉默突变（防止供体重切）。
化学修饰：3'端硫代磷酸酯化（增强稳定性，IDT可合成）。
3. 受精卵注射
注射混合物：
Cas9 mRNA (50 ng/μL) + gRNA (25 ng/μL) + ssODN (100 ng/μL)。
胚胎处理：
注射后培养至囊胚期，移植至假孕母鼠。
4. 基因型鉴定
初筛PCR：扩增含突变位点的片段（引物距突变位点>50 bp）。
深度测序：
使用ICE工具分析NGS数据，计算HDR效率。
敏感方法：ddPCR检测低频突变（<1%）。
5. 品系建立与验证
传代验证：F0可能为嵌合体，需与野生型交配获得稳定遗传。
功能验证：
蛋白质印迹（检测突变蛋白表达）。
酶活检测（如代谢酶突变需测活性）。
三、ES细胞打靶方案（超高精度）
1. 靶向载体构建
同源臂设计：5'和3'臂各1.5-2 kb，中间含目标突变。
筛选标记：
正选择：NeoR（后续可通过Flp删除）。
负选择：DTA（减少随机整合）。
2. ES细胞筛选与验证
阳性克隆鉴定：
长片段PCR（扩增整个重组区域）。
Sanger测序确认突变位点。
3. 小鼠制备
通过囊胚注射获得嵌合体，与Flp deleter小鼠交配删除NeoR。
四、Base Editing方案（无DSB风险）
1. 系统选择
C→T突变：用BE4max + gRNA（靶向C在窗口4-8位）。
A→G突变：用ABE8e + gRNA（靶向A在窗口4-7位）。
2. 效率优化
注射浓度：
BE4max mRNA (100 ng/μL) + gRNA (50 ng/μL)。
胚胎基因型：
需检测旁系编辑（预测工具：BE-Hive)。
五、经典案例解析
突变类型 | 疾病模型 | 构建方法 |
BRAF V600E | 黑色素瘤 | CRISPR-HDR + ssODN |
TP53 R175H | Li-Fraumeni综合征 | ES细胞同源重组 |
CFTR ΔF508 | 囊性纤维化 | Base Editing (C→T) |
六、常见问题与解决
问题 | 原因 | 解决方案 |
HDR效率低 | ssODN稳定性不足 | 使用硫代磷酸酯修饰ssODN |
嵌合体突变丢失 | 生殖系未传递 | 增加F0交配数量，筛选生殖系传递后代 |
非预期旁系突变 | Base Editing脱靶 | 选择高特异性gRNA，验证全基因组脱靶 |
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