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稳转株筛选与鉴定

简要描述:利用哺乳动物系统生产蛋白的方式有两种:瞬时转染和稳转株筛选。通过稳定细胞系构建筛选稳定表达细胞株。针对瞬时转染,外源基因在短时间转录翻译得到的蛋白量较少,能够满足小量蛋白制备,大量生产成本很高。相对于此,稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上,随着细胞的生长分裂外源基因可以稳定转染表达,同时经过抗生素加压筛选,最终得到能够稳定转染表达蛋白的细胞株,稳转株生产蛋白稳定性更好,批次差异性更小。

  • 更新时间:2021-07-09 13:53:02
  • 访  问  量:396

详细介绍

制备稳转株的实验步骤

一.准备及预实验

1、确定细胞系相关信息:需包括如下内容

细胞系名称

细胞培养条件

细胞增殖速度

支原体污染情况

2、查阅慢病毒感染该细胞的MOI值

3、预实验确定筛选药物用量:

(1)查阅Puromycin/Blastincidin在目的细胞中稳转株筛选的致死用量信息;参考查阅得到的数据,确定3个药物浓度梯度(如没有相关信息,则需将药物浓度梯度范围增大,数量增多至6个);

(2)D0将细胞铺于6孔板中,使D1细胞融合度约90%;D1按(1)中设置的药物梯度,加入药物;

(3)D4换液,并重新加入药物;

(4)D7观察,找到致死率100%的孔,该孔使用的药物浓度,即为药物筛选浓度。

二.稳转株筛选及构建

注:以下实验参数,按1株稳转株为例描述,实验需考虑有无对照稳转株!

1、细胞铺板:D0将细胞接种于6孔板中(4个孔),使D1细胞融合度约70%

病毒感染:

2、慢病毒上清:分别弃去6孔板中3个孔的0.5毫升培养基、1毫升培养基、2毫升培养基和,分别加入2毫升慢病毒上清、1.5毫升慢病毒上清和0.5毫升慢病毒上清;

3、纯化慢病毒:选3个孔,并可按推荐MOI、大于此MOI及小于此MOI,共三个MOI值,添加慢病毒;

4、观察感染效率:感染后72小时,观察感染效率,效率高于80%最佳,最低不应低于40%,选择1-2个感染效率较好的孔。

5、筛选:

(1)多克隆稳转株:从感染72小时后开始于6孔板中加筛选药物,每隔2天,重新换液加入药物。药物筛选需至少持续14天,直至显微镜下观察荧光细胞比例为100%。

注:第一次加入药物时在上午进行,4-6小时后观察细胞状态,如细胞死亡过多,需更换新鲜不含药物的培养基。

(2)单克隆稳转株:建立在获得多克隆稳转株基础上。

A、有限稀释法:

a.取24个1.5毫升EP管,每管中加入800毫升完全培养基;

b.用胰酶将多克隆稳转株消化(90%融合度,10毫升培养基终止消化),取80微升至第一个EP管中,混合均匀;

注:应使用1000微升枪尖,混合时不要过度吸打,以免破坏细胞。

c.从第一个EP管中取80微升至第二个EP管中,混合均匀,以此类推。

d.将EP管中的细胞悬液,以每孔100微升,接种于96孔板中;

e.过夜培养后,观察第12-24列,寻找只含有1个细胞的孔,并做好标记;

f.培养3-4周,待标记孔中细胞扩增后,消化传代扩增,即为单克隆稳转株细胞。

注:培养的第一周不要换液,接下来每3-4天换液。

B、平板挑取法

a.计数100个多克隆稳转株细胞,接种于一个10cm培养盘中;

注:尽量吹打均匀,防止细胞聚团。

b.过夜培养后,观察并寻找单个细胞的位置,并在盘底做标记;

c.培养2周;

注:培养的第一周不要换液,接下来每3-4天换液。

d.待标记处的细胞扩增为肉眼可见的白点,使用10微升移液器,调至最大量程,在尖端吸取一点胰酶(约5微升,且尖端为空气),缓慢滴至白点处,保持枪尖静置在白点上,且不让胰酶留出白点所在范围,1min后,迅速吹打,将消化下的细胞转移至96孔板中,传代扩增,即为单克隆稳转株细胞。约需2-3周。

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