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过表达转基因小鼠
外源基因（如人类疾病相关基因）随机插入基因组，导致组成型或组织特异性过表达。
基因敲入（Knock-in, KI）小鼠
将外源基因精准插入特定位点（如内源基因启动子控制下），或引入点突变/报告基因（如GFP）。
条件性转基因小鼠
利用组织特异性Cre/loxP系统实现时空特异性表达（如仅在肝脏中表达）。
适用场景：随机插入过表达转基因
步骤：
载体设计：构建包含目标基因的质粒（需有启动子、外源基因、polyA信号等）。
线性化DNA制备：去除质粒骨架，提高整合效率。
受精卵注射：将DNA注射到受精卵的原核中（C57BL/6等品系）。
胚胎移植：将注射后的胚胎移植到假孕母鼠子宫。
基因型鉴定：通过PCR或Southern blot检测F0代小鼠的转基因整合。
优缺点：
优点：技术成熟，适用于大片段（可达数百kb）。
缺点：随机整合可能导致表达不稳定或位置效应。
适用场景：精准插入或内源基因替换
步骤：
设计gRNA和供体DNA：
gRNA靶向插入位点，供体DNA包含同源臂（~800 bp）和目标序列。
递送系统：
将CRISPR组件（Cas9 mRNA + gRNA）与供体DNA共注射到受精卵。
验证：通过长片段PCR或测序确认精准整合。
优缺点：
优点：高效、精准，可插入大片段（需结合同源重组）。
缺点：需优化同源重组效率，可能产生非预期插入。
适用场景：复杂修饰（如条件性敲入）
步骤：
构建靶向载体：含同源臂、目标基因及筛选标记（如NeoR）。
ES细胞转染与筛选：通过阳性/阴性选择（如PNS）获得正确重组的ES克隆。
囊胚注射：将ES细胞注入囊胚，移植后获得嵌合体小鼠。
繁育传代：嵌合体与野生型交配获得杂合子后代。
优缺点：
优点：精准可控，适合复杂设计。
缺点：周期长（6个月以上），成本高。
Cre-loxP系统
将目标基因两侧插入loxP位点，与组织特异性Cre小鼠交配后实现条件性表达或敲除。
常用启动子：Alb（肝脏）、Nestin（神经）、Vil1（肠道）。
Tet-On/Off系统
通过四环素或强力mei素诱导基因表达（如肝特异性Tet-OFF-Alb-rtTA）。
表达验证
需通过qPCR、Western blot或免疫组化确认外源基因表达水平和组织分布。
表型分析
根据目标基因功能设计表型检测（如行为学、病理学、代谢指标）。
品系选择
常用背景品系：C57BL/6（遗传稳定）、BALB/c（免疫研究）。
遗传稳定性
需连续传代验证转基因的稳定遗传（部分品系可能出现沉默或丢失）。
| 问题 | 可能原因 | 解决方案 |
|---|---|---|
| 转基因未整合 | 注射DNA质量低或效率不足 | 优化DNA纯化，提高注射技术 |
| 表达水平低 | 位置效应或启动子弱 | 使用绝缘子（如HS4）或强启动子（CAG） |
| 嵌合体比例低 | ES细胞贡献不足 | 选择高贡献ES细胞系（如JM8） |
| 非特异性表型 | 插入突变或脱靶效应 | 多独立品系验证，全基因组测序排查 |
阿尔茨海默病模型：过表达人类APP突变基因（如APP/PS1双转基因）。
癌症模型：条件性激活致癌基因（如KrasG12D; p53loxP）。
报告基因模型：敲入荧光蛋白（如Rosa26-LSL-tdTomato）追踪细胞谱系。
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