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一、KI小鼠模型构建技术路线选择
方法 | 周期 | 插入片段限制 | 适用场景 |
CRISPR-HDR | 2-4个月 | <5 kb | 快速构建短片段KI（如点突变、FLAG标签） |
ES细胞同源重组 | 6-12个月 | 无限制 | 大片段插入（如Cre重组酶、人源化基因） |
CRISPR-转座子/病毒 | 3-5个月 | 10-50 kb | 超大片段插入（如BAC转基因替代） |
二、KI小鼠模型构建CRISPR-HDR方案（短片段插入推荐）
1. 靶点设计与供体制备
gRNA设计：
靶向插入位点（避开功能域），使用CHOPCHOP优化效率。
供体DNA设计：
5'同源臂 60-100nt
目标序列+筛选标记*
3'同源臂 60-100nt
化学修饰：ssODN（单链）需3'硫代磷酸酯化，dsDNA（双链）需磷酸化。
沉默突变：在gRNA靶区引入1-2 bp突变防止重切（必需！）。
2. 受精卵注射
注射混合物：
Cas9蛋白 (50 ng/μL) + gRNA (25 ng/μL) + ssODN/dsDNA (100 ng/μL)。
胚胎移植：
移植20-30个注射后胚胎至假孕母鼠。
3. 基因型鉴定
PCR策略：
外侧引物（同源臂外） + 内侧引物（插入序列内）→ 仅阳性鼠能扩增。
测序验证：确保插入序列无indel突变。
4. 品系建立
F0嵌合体：与野生型交配，筛选生殖系传递后代（通常50%概率）。
三、ES细胞同源重组方案（大片段KI）
1. 靶向载体构建
5'同源臂 1.5-3kb
目标序列
FRT-flanked NeoR
3'同源臂 1.5-3kb
DTA负选标记
关键元件：
同源臂：长度与插入片段正相关（>5 kb插入需≥3 kb同源臂）。
筛选标记：NeoR（后续可通过Flp删除）。
2. ES细胞操作
电转与筛选：
G418（NeoR）筛选10-14天，Pick 200-300个克隆。
阳性克隆验证：
长片段PCR（覆盖整个插入区域）。
Southern blot：确认单拷贝整合。
3. 小鼠制备
囊胚注射：将阳性ES细胞注入C57BL/6N囊胚。
传代：嵌合体与Flp deleter小鼠交配删除NeoR。
四、条件性KI（cKI）附加设计
1. 双loxP系统
策略：在目标基因前插入loxP-stop-loxP（LSL）结构，与Cre小鼠交配后激活表达。
应用：
报告基因：Rosa26-LSL-tdTomato。
致癌基因：Kras-LSL-G12D。
2. 诱导型系统
Tet-On：rtTA + TRE-目标基因，需多xi环素诱导。
五、经典KI模型案例
插入类型 | 应用 | 代表模型 |
点突变 | 模拟人类遗传病（如APP突变） | APP-KI（阿尔茨海默病） |
报告基因 | 细胞谱系追踪 | Rosa26-CAG-LSL-GFP |
人源化基因 | 药物测试 | hCYP3A4-KI（代谢研究） |
六、关键优化策略
提高HDR效率：
添加HDR增强剂（如Rad51 mRNA或RS-1）。
使用Cas9变体（如Cas9-D10A nickase）。
减少随机整合：
线性化供体DNA（避免质粒骨架整合）。
表型验证：
mRNA水平：qPCR检测插入基因表达。
蛋白水平：抗体检测（如HA/FLAG标签）。
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