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目标基因（GOI, Gene of Interest）
将外源基因（如报告基因、突变基因或荧光蛋白）插入内源基因位点，或替换特定外显子。
条件性调控系统
Cre-loxP系统：通过组织特异性Cre重组酶实现条件性激活。
FLEx（Flip-Excision）系统：结合Flp-FRT和Cre-loxP实现多重调控。
诱导型系统（如Tet-on/off、他莫xi芬诱导的Cre-ERT2）。
启动子：αMHC（Myh6）、cT*T（Tnnt2）驱动Cre表达。
报告基因：如tdTomato（loxP-stop-loxP-tdTomato）用于追踪表达。
靶位点选择
安全港位点（如Rosa26、H11）或内源基因位点（需同源重组）。
避免干扰邻近基因（需UCSC基因组浏览器分析）。
条件性敲入结构（以Rosa26-loxP-STOP-loxP-GOI为例）：
5'同源臂 + loxP-STOP-loxP + GOI + 3'同源臂 + 筛选标记（如Neo）。
CRISPR-Cas9介导的KI
设计sgRNA靶向插入位点，与供体载体共注射至受精卵。
供体载体：包含同源臂和条件性表达盒（如图1）。
ES细胞打靶（传统方法）
电转ES细胞后筛选阳性克隆，显微注射至囊胚。
Founder小鼠鉴定
PCR或Southern blot验证正确整合。
与Cre品系交配
例如：Rosa26-lsl-GOI × αMHC-Cre → 心脏特异性GOI表达。
PCR：检测loxP位点、GOI插入及Cre重组效率。
测序：确认无脱靶突变。
qRT-PCR/Western blot：检测GOI在心脏中的表达水平。
免疫荧光/组织染色：定位GOI表达（如tdTomato荧光）。
心脏功能：超声心动图（EF%、FS%）、心电图（心律失常）。
病理分析：心肌纤维化（Masson）、 hypertrophy（WGA染色）。
解决：优化Cre品系（如高表达αMHC-Cre）或使用诱导型Cre（他mo昔芬）。
优化：加强STOP序列（如三重polyA信号）或选择更严格的启动子。
解决：全基因组测序（WGS）筛选Founder小鼠。
构建：Rosa26-lsl-tdTomato × αMHC-Cre → 心肌细胞红色荧光标记。
用途：追踪心肌细胞谱系或移植细胞命运。
构建：Knock-in loxP-STOP-loxP-mutant-Kras × cT*T-Cre → 心肌特异性致癌突变模型。
对照设计：
必须包括：无Cre的GOI小鼠（loxP-STOP-loxP-GOI）、Cre单独表达小鼠。
时间控制：
诱导型Cre（如Cre-ERT2）需优化他mi昔芬剂量和时间窗口。
伦理与标准化：
遵循ARRIVE指南，确保动物福利和实验可重复性。
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