微生物基因编辑

1. 微生物基因编辑常用基因编辑技术

A. CRISPR-Cas系统（最主流）

• 工具组成：

• Cas蛋白：常用Cas9（化脓链球菌）、Cas12a（更小，适合紧凑基因组）。

• sgRNA：引导Cas蛋白靶向特定DNA序列。

• 修复模板（HDR）：用于精确插入或替换基因。

• 优势：高效、多靶点编辑、适用于多种微生物。

• 适用微生物：细菌（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌）、真菌（酵母、丝状真菌）、古菌。

B. 传统同源重组（HR）

• 原理：通过同源臂介导的DNA重组实现基因替换或敲除。

• 适用场景：CRISPR效率低的微生物（如某些乳酸菌）。

• 关键步骤：构建含同源臂的线性DNA片段，电转化或接合转移。

C. 其他工具

• Base Editing（碱基编辑）：无需DSB，直接转换C→T或A→G（如CRISPR-Cas9-脱氨酶融合蛋白）。

• Prime Editing：更精准的插入、缺失和点突变。

• 转座子/噬菌体整合：适用于无高效编辑工具的微生物（如某些放线菌）。

2. 微生物基因编辑实验流程（以CRISPR-Cas9为例）

A. 设计阶段

1. 靶点选择：

• 使用工具（如CRISPRko）设计sgRNA，避免脱靶。

• 目标序列要求：NGG PAM（Cas9）或TTTV PAM（Cas12a）。

2. 修复模板设计（如需敲入）：

• 同源臂长度：细菌（~500 bp），真菌（~1 kb）。

B. 载体构建

• 表达系统：

• 质粒载体：适合短期编辑（需抗性筛选）。

• 染色体整合：稳定表达Cas9（如大肠杆菌BL21(DE3)-Cas9）。

• 递送方式：

• 电转化（细菌）、PEG介导（真菌）、接合转移（难以转化的菌种）。

C. 编辑与筛选

1. 转化/转染：将CRISPR组件导入微生物。

2. 筛选：

• 抗性标记：如卡那m素（KanR）、氯m素（CmR）。

• 表型筛选：荧光报告基因（GFP）、营养缺陷型补偿（如leu2-）。

3. 验证：

• PCR+测序：确认目标编辑。

• 功能验证：如酶活检测、生长曲线。

3. 应用领域

A. 基础研究

• 基因功能研究：必需基因敲除、启动子替换。

• 调控网络解析：如细菌双组分系统突变体构建。

B. 工业生物技术

• 代谢工程：

• 大肠杆菌生产胰岛素、琥珀酸。

• 酵母合成青h素、β-胡萝卜素。

• 酶改造：定向进化提高酶热稳定性（如Taq DNA聚合酶）。

C. 医学应用

• 疫苗开发：减毒活疫苗（如删除致病基因的结核分枝杆菌）。

• 抗菌策略：

• 编辑益生菌（如乳酸菌）递送治疗分子。

• 噬菌体编辑靶向耐药菌（如MRSA）。

D. 环境修复

• 工程菌：降解污染物（如Pseudomonas编辑降解石油）。

4. 挑战与解决方案

A. 编辑效率低

• 优化方案：

• 调整Cas蛋白表达量（避免毒性）。

• 使用ssDNA修复模板（提高HDR效率）。

B. 递送困难

• 解决方案：

• 原生质体转化（真菌）。

• 噬菌体包裹CRISPR组件（针对顽固细菌）。

C. 脱靶效应

• 控制方法：

• 高保真Cas变体（如Cas9-HF1）。

• 全基因组测序验证。

5. 前沿技术

• 多基因编辑：同步敲除/敲入多个基因（如酵母基因组精简计划）。

• 无痕编辑：通过FLP/FRT或Cre-loxP删除筛选标记。

• 体内编辑：口服CRISPR胶囊靶向肠道菌群（如治疗苯b酮尿症）。

6. 实验示例：大肠杆菌基因敲除

1. 设计sgRNA：靶向lacZ基因（5'-GCTATGACCATGATTACGA-3' + NGG）。

2. 构建质粒：将sgRNA和Cas9克隆至pTarget载体。

3. 电转化：导入大肠杆菌DH5α，涂布Amp平板。

4. 验证：

• 蓝白斑筛选（lacZ-菌落为白色）。

• PCR扩增靶区域并测序。